Les parents d'Alyson Hannigan ont divorcé quand elle avait 2 ans. Sa mère, Emilie, est agente immobilière à Atlanta et son père, Al, d'origine irlandaise, est conducteur de camions dans le Missouri.

Elle a commencé sa carrière d'actrice en tournant des publicités dès l'âge de quatre ans à Atlanta. À l'âge de onze ans, elle s'installe à Hollywood et fait ses études secondaires à la North Hollywood High School dont elle sort diplômée en 1992.

Durant son adolescence, elle participe à plusieurs séries télévisées comme Roseanne.

Elle suit, brièvement, des cours de psychologie avant de se consacrer à sa carrière d'actrice.

Elle se fait connaître mondialement, grâce à son interprétation du personnage de Willow Rosenberg dans la série télévisée fantastique Buffy contre les vampires. Par la suite, elle confirme sur le petit écran grâce au rôle de Lily Aldrin dans la sitcom comique How I Met Your Mother .

Au cinéma, elle est célèbre pour avoir joué Michelle Flaherty dans la saga cinématographique American Pie, Amour, mariage et petits tracas, mais aussi récemment dans le film à succès Flora & Ulysse par Disney+.

Alyson Hannigan a fréquenté Ginger Fish, l'ancien batteur de Marilyn Manson, de 1990 à 1998.

En 1999, elle rencontre l'acteur Alexis Denisof sur le tournage de Buffy contre les vampires, qui interprète Wesley Wyndam-Pryce dans la troisième saison de la série. Ils entament une relation l'année suivante, puis se fiancent en 2002 et se marient le 11 octobre 2003 à Desert Hot Springs en Californie. Le couple a deux filles : Satyana Marie Denisof (née le 24 mars 2009) et Keeva Jane Denisof (née le 23 mai 2012).

Dans le domaine des activités caritatives, elle est l'une des actrices porte-parole de la ligue américaine contre le cancer du sein.