Florence Pugh est née le 3 janvier 1996 à Oxford. Son père, Clinton Pugh, est restaurateur, et sa mère, Deborah, est professeur de danse. Issue d'une famille de quatre enfants, elle a un frère, l'acteur Toby Sebastian connu pour son rôle dans la série télévisée Game of Thrones, et deux sœurs, Arabella et Rafaela.

Enfant, Pugh souffre de trachéomalacie et va régulièrement à l'hôpital. Espérant qu'un climat plus chaud améliore son état de santé, sa famille déménage en Espagne alors qu'elle est âgée de trois ans, dans la ville andalouse de Sotogrande. Elle y réside jusqu'à l'âge de six ans, puis retourne avec sa famille en Angleterre, sans amélioration notable de sa santé. Cette maladie est à l'origine de sa voix rauque caractéristique.

Dès l'âge de six ans, Pugh commence à exprimer sa passion pour la comédie après avoir interprété Marie dans une crèche vivante en utilisant un accent du Yorkshire. Elle a étudié à la Wychwood School et à la St Edward's School d'Oxford, deux écoles privées. Elle révèle plus tard que ces écoles ne l'ont jamais encouragée, ni accompagnée dans ses projets de devenir actrice.

Après avoir fait ses débuts dans le drame The Falling, Florence Pugh se fait connaître en 2016 grâce à son rôle principal dans The Young Lady, qui lui permet de remporter le prix de la meilleure actrice aux British Independent Film Awards. En 2018, elle est à l'affiche de la mini-série télévisée The Little Drummer Girl.

En 2019, elle interprète la catcheuse Saraya, sous le nom de Paige, dans le biopic Une famille sur le ring. La même année, son rôle dans le film d'horreur Midsommar d'Ari Aster lui permet de se faire connaître à l'international grâce aux éloges qu'elle reçoit pour sa performance. Elle interprète ensuite Amy March dans Les Filles du docteur March de Greta Gerwig, rôle pour lequel elle est nommée aux Oscars dans la catégorie meilleure actrice dans un second rôle en 2020.

En 2021, elle rejoint l'univers cinématographique Marvel en devenant l'interprète de Yelena Belova, qu'elle joue pour la première fois dans le film Black Widow, avant de le reprendre dans d'autres productions de l'univers.

En 2023, elle joue le rôle de Jean Tatlock dans le film Oppenheimer et interprète l'année suivante la princesse Irulan dans Dune, deuxième partie.