Laura Jeanne Reese Witherspoon est née le 22 mars 1976 au Southern Baptist Hospital de La Nouvelle Orléans, en Louisiane, alors que son père le docteur John Draper Witherspoon était étudiant à la faculté de médecine de l'Université Tulane. Son père, né en Géorgie, était lieutenant de l'armée de réserve américaine et faisait, jusqu'en 2012, de la pratique privée d'ORL. Sa mère, le docteur Mary Elizabeth « Betty » (née Reese), originaire d'Harriman, au Tennessee, a obtenu cinq diplômes y compris un doctorat en sciences infirmières en pédiatrie. Elle est devenue professeure de sciences infirmières à l'Université Vanderbilt. Elle a revendiqué être la descendante de John Witherspoon, qui signa la Déclaration d'indépendance. Cependant, cette affirmation n'a pas été vérifié par les généalogistes de la Société des descendants des signataires de la Déclaration d'indépendance. Ses parents sont toujours légalement mariés, bien qu'ils se soient séparés en 1996. Reese a des origines anglaises, irlandaises, écossaises, galloises ainsi que des lointaines origines néerlandaises.

Le père de Reese Witherspoon a travaillé pour l'armée américaine à Wiesbaden, en Allemagne, où elle vécut pendant quatre ans.

Après son retour aux États-Unis, elle passe son enfance à Nashville, au Tennessee. Reese Witherspoon a été élevé en tant qu'épiscopalienne et a déclaré qu'elle était fière de « l'éducation définitive du Sud » qu'elle avait reçue. Elle a déclaré que cela lui donnait « un sens de la famille et des traditions » et lui a enseigné « à être consciencieuse face aux sentiments des gens, à être polie, à être responsable et à ne jamais prendre pour acquis ce que vous avez dans la vie ».

À l'âge de sept ans, Reese Witherspoon est choisie comme modèle pour les publicités télévisées d'un fleuriste, ce qui la motive à prendre des cours de théâtre. À l'âge de onze ans, elle prend la première place au Ten-State Talent Fair. Elle a obtenu de bonnes notes à l’école, a adoré la lecture et s’est considérée elle-même comme « une grosse idiote qui lisait plein de livres ». En mentionnant son amour pour les livres, elle a déclaré : « Je deviens folle dans une librairie. Cela me fait battre le cœur parce que je veux tout acheter ». Elle a été qualifié comme « multi-performante » et ses parents lui ont donné le surnom de « Little Type A ».

Elle est diplômée de la Harpeth Hall School, une école de filles de Nashville, où elle était pom-pom girl. Plus tard, elle a étudié à l'université Stanford pour obtenir une majeure en littérature anglaise, mais a quitté l’école avant de terminer ses études pour poursuivre une carrière d'actrice.

Élevée à Nashville, au Tennessee, Reese Witherspoon commence sa carrière d'actrice à l'adolescence avec le film Un été en Louisiane en 1991. Après un rôle de premier plan aux côtés de Mark Wahlberg dans le thriller Obsession mortelle en 1996, elle fait une percée en 1999 pour son rôle d'Annette Hargrove dans la comédie dramatique Sexe Intentions ainsi que pour son interprétation de Tracy Flick dans la comédie L'Arriviste. Elle obtient une reconnaissance plus large avec le rôle d'Elle Woods dans la comédie La Revanche d'une blonde, ainsi qu'en tant que rôle principal dans Fashion victime. C'est surtout le rôle de June Carter dans le biopic musical Walk the Line en 2005 qui lui apporte la consécration avec l'Oscar de la meilleure actrice.

Après un ralentissement dans sa carrière après son sacre aux Oscars, avec De l'eau pour les éléphants pour seul film marquant durant cette période creuse, elle signe son grand retour en 2014 en produisant le thriller Gone Girl, mais aussi en tenant le rôle de Cheryl Strayed dans le drame Wild, dont elle est également productrice. Sa prestation dans Wild lui vaut sa seconde nomination à l'Oscar de la meilleure actrice. Reese Witherspoon s'est également aventurée vers la télévision en produisant et en incarnant l'un des rôles principaux de la série Big Little Lies sur HBO, qui remporte l'Emmy Award de la meilleure mini-série. En 2019, elle produit et joue dans la série dramatique Apple TV+ The Morning Show.

Reese Witherspoon possède également une entreprise de vêtements (Draper James) et anime un club de livres (Reese's Book Club). Elle est actionnaire et administratrice de la société Hello Sunshine qu'elle a créée et dont elle a cédé ultérieurement le contrôle.

Elle est activement impliquée dans des organisations de défense des enfants et des femmes. Elle siège au conseil d'administration du Children's Defence Fund et a été nommée ambassadrice mondiale d'Avon Products en 2007. Elle est présidente honoraire de la fondation caritative d'Avon Products. Elle a reçu une étoile sur le Walk of Fame à Hollywood en 2010. Elle co-fonde en 2000 la compagnie de production Type A Films qui devient en 2016 Hello Sunshine, laquelle se concentre sur des histoires centrées sur des personnages féminins, et a produit un bon nombre de films et de séries télévisées.

Reese Witherspoon a cité les actrices Jodie Foster, Meryl Streep, Holly Hunter, Susan Sarandon, Frances McDormand, Debra Winger, Diane Ladd, Julia Roberts, Nicole Kidman, Jennifer Aniston, Goldie Hawn, Sally Field, Sigourney Weaver, Lucille Ball, Carole Lombard, Judy Holliday, Gena Rowlands et les acteurs Tom Hanks, Jack Nicholson et Michael Keaton comme influences sur son jeu d'actrice. Ses films préférés sont La Fièvre dans le sang, Waiting for Guffman, Broadcast News, Arizona Junior et Un couple à la mer.

Reese rencontre l'acteur Ryan Phillippe le jour de son 21^e anniversaire, en mars 1997. Ils se fiancent en décembre 1998 puis se marient le 5 juin 1999 à Charleston en Caroline du Sud. Ils ont deux enfants : une fille prénommée Ava Elizabeth Phillippe (née le 9 septembre 1999) et un fils prénommé Deacon Reese Phillippe (né le 23 octobre 2003). En octobre 2006, Reese et Ryan annoncent leur séparation. Le mois suivant, le couple annonce qu'il est en procédure de divorce citant des « différents irréconciliables ». Leur divorce est officialisé en 2008.

En 2007, Reese entame une relation amoureuse avec l'acteur Jake Gyllenhaal. Le couple se sépare en décembre 2009.

En février 2010, Reese commence à fréquenter Jim Toth. Ils annoncent leurs fiançailles en décembre 2010 puis ils se marient le 26 mars 2011 à Ojai en Californie. Le 27 septembre 2012, Reese met au monde un garçon prénommé Tennessee James. C'est le troisième enfant de l'actrice et le premier de Jim.

En 2013, Witherspoon a été arrêtée pour trouble à l'ordre public après l'interpellation de son mari, soupçonné de conduite en état d'ivresse. Plus tard, elle n'a pas contesté les charges et a dû payer les frais de justice.

Elle est proche de l'actrice Jennifer Aniston et de l'acteur Robert Pattinson, avec qui elle joue dans le film De l'eau pour les éléphants et de l'actrice Sofia Vergara.

En mars 2023, elle annonce son divorce sur les réseaux sociaux.

En 2023, elle devient l'actrice la plus riche du monde selon le magazine Forbes, avec une fortune estimée à 440 millions de dollars. Cela la place au 59e rang des femmes américaines ayant fait fortune par leurs propres moyens.