Zachary Quinto est né le 2 juin 1977 à Pittsburgh. Il grandit dans le quartier de Green Tree. Il entre à l'école Saints Simon and Jude Catholic School. Sa mère, Margaret J. « Margo » (née McArdle), travaille à lasociété d'investissement et, plus tard, au bureau du magistrat. Son père, Joseph John « Joe » Quinto, est barbier. En 1984, ce dernier meurt de cancer . Avec son frère Joe, il est élevé par sa mère. Il grandit catholique. Son père est d'origine italienne et sa mère, d'origine irlandaise.

En 1995, il est diplômé au Central Catholic High School (Pittsburgh), où il avait participé à la comédie musicale et gagné le prix Gene Kelly du meilleur acteur dans un second rôle. Il intègre l'école de théâtre de l'université Carnegiontellon, dont il sort diplômé en 1999.

Zachary Quinto commence le théâtre avant de se faire connaître sur le petit écran avec quelques apparitions dans plusieurs séries (Charmed, 24 heures chrono, Lizzie McGuire).

C'est de 2006 à 2010 qu'il connait véritablement le succès avec le rôle du tueur en série Gabriel Gray (Sylar) dans la célèbre série Heroes. La série est cependant annulée au bout de quatre saisons en raison d'une baisse d'audience.

Côté cinéma, son rôle du charismatique Sylar se fait remarquer et ainsi la présence de Zachary Quinto dans le nouveau film de la série Star Trek est officiellement annoncée lors du Comic-Con de 2007. Il est choisi par le réalisateur J. J. Abrams pour le rôle de Spock, succédant ainsi à Leonard Nimoy qui a été jusque-là le seul acteur à interpréter le personnage depuis les années 1960. Dans ce nouveau film qui reprend les bases de la série originale, Zachary Quinto joue un jeune Spock tiraillé par ses émotions et rencontrant un James T. Kirk (Chris Pine) fougueux et inexpérimenté, loin d'être le célèbre capitaine de l’Enterprise tel que nous le connaissons. Ce renouveau de la licence Star Trek apporta à Quinto une certaine célébrité, le film ayant été un franc succès. Son frère, Joe Quinto, joue également dans le film en tant que Romulien faisant partie de l'équipage du vaisseau Narada.

Le 16 octobre 2011, l'acteur évoque son homosexualité pour la première fois lors d'un entretien donné au New York Magazine et revient sur Angels in America, pièce de théâtre dans laquelle il interprète un homme dont le petit ami est atteint du sida.

Il a eu une liaison avec Jesse Tyler Ferguson. Il a été en couple avec Jonathan Groff, mais leur relation a pris fin en juillet 2013. Fin août 2014, il poste une photographie de son compagnon le top-model Miles McMillan, sur son compte Instagram. En 2019, les deux hommes se séparent, après une relation qui aura duré six ans.

Il est également un ami de Matthew Bomer, qu'il connaît depuis l'université Carnegie-Mellon.